Allo stato attuale, le cosiddette “biopsie liquide” o, più propriamente, l’analisi del DNA tumorale circolante (ctDNA) costruiscono senza dubbio un valido strumento per accertare la malattia minima residua e per ricercare le “mutazioni bersaglio” per specifici bio-farmaci.
I liquidi biologici da cui si può estrarre ctDNA sono vari (sangue, urine, liquido cefalorachidiano), ma la matrice di partenza principale è il sangue interno da cui è possibile ottenere anche ctRNA, miRNA la cui applicazione clinica è ad oggi ancora limitata pertanto ci focalizzeremo solo sul ctDNA.

I vantaggi
A parte la minima invasività, il principale vantaggio dell’analisi del DNA tumorale circolante (ctDNA) consiste nella possibilità di ottenere uno spettro di informazioni che tenga conto di tutti i possibili cloni in cui, sotto la spinta selettiva terapeutica, il tumore primitivo si differenzia nel tempo (al contrario, analizzando il DNA di una singola cellula tumorale circolante si otterrebbero informazioni limitatamente al clone a cui essa appartiene).
Per tale ragione, le informazioni ottenute dall’analisi del ctDNA sono “attualizzate” e spesso significativamente differenti da quelle utilizzate analizzando il tessuto tumorale escisso chirurgicamente tempo addietro.

Biopsia liquida attravewrso sequenziamento NGS di 500 geni
La sequenziazione mediante tecnica NGS di 500 geni rappresenta l’analisi più completa per attualizzare il profilo genetico in neoplasie solide ed ematologiche in quanto è in grado di identificare varianti del DNA (SNV, Indel, CNV) a partire da:
FFPE, plasma/Siero per ottenere il TUmor Mutational Burden (TMB) che è la misura del numero di mutazioni riscontrate all’interno di un tumore, l’instabilità microsatellitare (27 MSI makers) e il rivelamento di hotspost mutazionali per terapie mirate.

Le soluzioni di TomaLab

• • Fornitura di provette Streck Cell-Free DNA BCT
  • Servizio di prelievi a domicilio mediante Infermieri Professionali
  • Servizio di logistica personalizzata e consegna a TomaLab entro 24-48 ore
  • PDL-1 incluso senza costi aggiuntivi (Immunoist ochimica)
  • Rilascio del referto entro 15 giorni lavorativi dall’arrivo del campione
  • Consulenza del Medico Genetista

Homologous Recombination Deficiency – HRD

La ricombinazione omologa (HR) è un processo indispensabile per la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA e coinvolge diversi mediatori, in particolare BRCA1 e BRCA2. Quando non è funzionante si parla di deficienza di ricombinazione omologa (HRD-Homologous Recombination Deficiency).

L’alterazione nei geni HR è presente in molti tipi di cancro (13%–17%), in particolare nel tumore della mammella, dell’ovaio e del pancreas. BRCA1 e BRCA2 sono i geni HR più frequentemente alterati, con varianti patogene sia germinali che somatiche, ma anche altri geni (MRE11, RAD50, NBS1, CtIP, RAD51, ATM, H2AX, PALB2, RPA, RAD52) fanno parte di questo meccanismo e possono essere responsabili di un rischio oncologico eredo famigliare.

LA PRESENZA DI UNA MUTAZIONE GERMINALE RAPPRESENTA UN FATTORE FAVORENTE L’HRD MA NON SUFFICIENTE IN QUANTO OCCORRE LA CONCOMITANZA DI PIÙ MUTAZIONI, CONDIZIONE CHE SI PUÒ REALIZZARE SOLO NEL TUMORE.

Ma la via della HRR (Homologous Recombination Repair) non è il solo meccanismo di riparazione a disposizione della cellula; esiste infatti anche il sistema della proteine PARP o Poly(ADP-Ribose) Polymerase, in grado di identificare un danno a livello del DNA e di attivare a cascata altre proteine in grado di riparalo.
Le proteine PARP sono il bersaglio molecolare dei PARP-inibitori.
Pertanto, una cellula tumorale già affetta da HRD risulterà particolarmente vulnerabile ai PARP-inibitori.

L’AIFA ha approvato la rimborsabilità di olaparib in combinazione con bevacizumab, nel trattamento di mantenimento di prima linea del carcinoma ovarico avanzato che presenti un difetto di ricombinazione omologa (HRD), difetto presente in circa il 50% dei casi.

La HRD può essere evidenziata solo mediante il sequenziamento NGS di un pannello di geni e la successiva analisi attraverso un algoritmo specifico. L’esame può essere eseguito a partire da tessuto tumorale (blocchetto paraffinato).

LE SOLUZIONI DI TOMALAB PER LA HRD SOMATICA:

• • Utilizzo in house di piattaforma NGS con soluzione SOPHiA DDM (Homologous Recombination Deficiency Solution), clinicamente validato a livello internazionale
  • Accettazione impegnative del SSN o convenzioni dirette con Enti ospedalieri
  • Ritiro materiale dietro delega del Paziente e spedizione a TOMALab
  • Consulenza del Genetista specialista in onco-farmaco-genomica

Soggetti diversi rispondono in modo differente allo stesso farmaco somministrato alla stessa dose. La ragione di ciò risiede in parte nelle differenze di assorbimento, metabolismo ed elimi-nazione dei farmaci tra diversi individui. Altre differenze si possono avere nelle modalita’ specifiche con cui il farmaco esercita il suo effetto, ad esempio vi possono essere differenze individuali del legame del farmaco con il bersaglio su cui agisce.

Tali differenze sono mediate da un largo numero di enzimi, ciascuno dei quali è prodotto da uno specifico gene. Molti di questi geni sono polimorfici nella popolazione, ed alcune varianti genetiche producono enzimi con diversi livelli di attività metabolica o attività in processi che determinano l’efficacia e/o la tossicità di un certo particolare farmaco.

L’attività farmacologica contro le cellule tumorali è associata quasi invariabilmente a fenomeni di tossicità nei confronti dei tessuti sani. I recenti progressi delle metodologie analitiche ed il sequenziamento del genoma hanno permesso la scoperta di varianti alleliche di geni coinvolti nel metabolismo dei farmaci, nella farmacocinetica o nella farmacodinamica: queste alterazioni possono essere correlate alla chemio-sensibilità o alla tolleranza nei confronti dei farmaci.

Il test permette il rilevamento e l’identificazione di 126 polimorfismi in 58 geni coinvolti nell’assorbimento, nella distribuzione, nel metabolismo, nell’eliminazione e nella tossicità dei chemioterapici antitumorali.

Tra gli altri, sono analizzati i seguenti geni:
DPYD, UGT1A1, CYP2D6, CYP3A4, CYP3A5, CYP2C9, ABCB1, GSTP1, TSER, ERCC1, RRM1, XRCC1, CDA.

Permettendo così l’analisi della tollerabilità e funzionalità di:

• • Fluoropirimidine
  • Irinotecano
  • Tamoxifene
  • Derivati del platino
  • Ciclofosfamide
  • Antracicline
  • Methotrexate
  • Trastuzumab
  • Simvastatin
  • Radioterapia

Metodica utilizzata

• • Estrazione automatizzata di DNA

Amplificazione tramite multiplex-PCR e spettrometria di massa MALDI-TOF (“MassARRAY® system” Agena) associata alla tecnologia Single Base Extension.

Sensibilità: il sistema è in grado di rilevare fino al 2,5% di allele mutato.

Caratteristiche del campione da inviare

• • Due provette da 6 ml in EDTA di sangue

PANNELLO RISCHIO ONCOLOGICO EREDITARIO
L’anamnesi familiare ed il test genomico per la predisposizione al cancro aiutano ad ottimizzare le decisioni iniziali relative all’assistenza ed al trattamento dei pazienti.
Il pannello analizza 27 geni di predisposizione per i principali tipi di tumori (mammella, colon, ovaio) e per le sindromi a rischio oncologico (Lynch, FAP, HNPCC).
Questi i geni analizzati:

*PMS2CL è parte dell’analisi ma non un gene responsabile della malattia

Metodica utilizzata
Sequenziamento massivo parallelo (NGS) di tutti gli esoni codificanti, delle regioni intro- niche fiancheggianti e dei grandi riarrangiamenti attraverso strumentazione Illumina ® Kit: Hereditary Cancer Solution (HCS™) di SOPHiA GENETICS CE-IVDLe mutazioni identificate in NGS e ritenute rilevanti per la clinica vengono confermate con metodo Sanger.

Caratteristiche del campione da inviare
Due provette, con EDTA, di sangue periferico.

PROSIGNA® (PAM50)
Il test prognostico della firma genica del cancro al seno Prosigna® è un’analisi diagnostica in vitro che utilizza il profilo di espressione genica di cellule prelevate dal tessuto tumorale mammario per determinare il rischio della paziente di recidiva a distanza. Il saggio misura il profilo di espressione genica utilizzando l’RNA estratto dal tessuto tumorale mammario fissato in formalina e incluso in paraffi na (FFPE).
I dati di espressione dei 50 geni sono ponderati insieme a variabili cliniche in modo da produrre un sottotipo (luminale A, luminale B, HER2-arricchito o basale) e un punteggio indicativo della probabilità di recidiva a distanza della malattia. Il test è indicato per quelle pazienti, in post-menopausa, colpite da cancro al seno che si sono già sottoposte a intervento chirurgico con positività al recettore ormonale (HR+), con stato linfonodale negativo o positivo stadio 0, I (1-3 linfonodi positivi) o appartenenti allo stadio II o IIIA.
Per stimare la precisione generale e la riproducibilità di Prosigna®, sono stati condotti due studi
indipendenti (ATAC e ABCSG-8) da due differenti laboratori i cui risultati sono stati combinati.

Valori attesi 
Il saggio Prosigna® consente di ottenere un punteggio ROR (0-100), un sottotipo intrinseco (Luminale A, Luminale B, HER2 arricchito o Basale) e una categoria di rischio (basso, medio o alto) per ogni campione di tessuto tumorale.

Probabilità di recidiva a distanza entro 10 anni
I punteggi ROR per 2 coorti di donne in post-menopausa colpite da cancro al seno in fase iniziale, positive al recettore ormonale, sono stati confrontati con la sopravvivenza senza recidiva a distanza e il trattamento con 5 anni di endocrinoterapia adiuvante seguita da 5 anni di osservazione. Questi due studi hanno dato origine ad un modello correlato al punteggio ROR per la probabilità di recidiva a distanza in questa popolazione di pazienti analizzata, comprendente un intervallo di confi denza del 95%.

Classifi cazione del rischio
Viene fornita anche la classifi cazione del rischio per consentire l’interpretazione del punteggio
ROR utilizzando i cutoff correlati al risultato clinico nelle popolazioni di pazienti analizzate

Metodica utilizzata

• • Estrazione manuale di RNA da tessuto tumorale.
  • Digital PCR sul sistema Dx nCounter® di NanoString.

Caratteristiche del campione da inviare

• • Campione di tessuto tumorale* fi ssato in formalina e incluso in paraffi na (FFPE).
    (Il materiale verrà restituito al termine dell’analisi).

Oppure

• • 4 vetrini in bianco da 10μm di spessore, più un vetrino colorato in ematossilina-eosina
    

* Il campione deve rientrare nei seguenti tipi di carcinoma mammario invasivo:
a. Carcinoma duttale invasivo
b. Carcinoma lobulare invasivo
c. Carcinoma invasivo con caratteristiche duttali e lobulari
(“carcinoma di tipo misto”)
d. Nessun tipo speciale (NST) o non specifi cato altrimenti (NOS)

Il laboratorio TOMA è in possesso delle seguenti certifi cazioni:

• • Accreditamento e convenzionamento con Servizio Sanitario Nazionale;
  • Certifi cazione ISO 9001:2008 n° cert. 194315
  • Certifi cazione laboratori di genetica medica SIGUCert 2009 n°certifi cato 004

Restiamo a Vs. disposizione per eventuali chiarimenti in merito.

Con più di 25.000 test eseguiti dal suo lancio nel 2020 e più di 3.000 casi/studi clinici pubblicati o presentati a congressi internazionali, SIGNATERA è lo strumento più avanzato a disposizione del Clinico per la diagnosi anticipata delle recidive ma anche per la valutazione della prognosi.

NON ESISTONO TUMORI CON LO STESSO IDENTICO DNA

SIGNATERA è la prima biopsia liquida veramente personalizzata in quanto nel DNA tumorale circolante vengono ricercate 16 mutazioni clonali permanenti che appartengono solo e soltanto al tumore primitivo e del quale costituiscono la “firma molecolare”. Queste mutazioni clonali vengono identificate mediante un algoritmo confrontando l’esoma del tessuto tumorale con l’esoma germinale (nativo) del Paziente. Viene così evitato di cercare mutazioni che nel tempo posso anche scomparire per la selezione naturale e indotta dalle terapie.

IL RISULTATO È UNA SPECIFICITÀ DEL 100% E UNA SENSIBILITÀ COSÌ ELEVATA DA RILEVARE UNA RICADUTA CON GRANDE ANTICIPO, ANCHE DI MESI) RISPETTO ALLA DIAGNOSI STRUMENTALE

Pertanto, SIGNATERA è particolarmente indicato per:

• • Monitoraggio risposta ai neoadiuvanti
  • Valutazione post-chirurgica (MRM)
  • Monitoraggio delle recidive
  • Determinazione dell’efficacia terapeutica attraverso le variazioni del ctDNA

Cosa occorre per eseguire il test SIGNATERATM ?

1. 1. La prima volta, a distanza di almeno tre settimane dall’intervento, occorre fornire
      il tessuto paraffinato (blocchetto o vetrini in bianco), prelevare una provetta con
      EDTA e due provette Streck Cell-Free DNA BCT®
   2. Per ogni successivo controllo, due provette Streck Cell-Free DNA BCT®

Le soluzioni di TomaLab

• • Fornitura di provette con EDTA e di provette Streck Cell-Free DNA BCT®
  • Servizio di gratuito di ritiro (dietro delega del Paziente) del blocchetto o
    dei vetrini
  • Servizio di prelievi a domicilio mediante Infermieri Professionali
  • Servizio di logistica personalizzata e consegna a TOMALab entro 24-48 ore
  • Rilascio del referto entro 15 giorni lavorativi dall’arrivo del campione
  • Consulenza del Medico Genetista